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Cryodropper-E 進行小鼠胚胎玻璃化冷凍和使用說明書

更新時間:2021-08-24      點擊次數:1974

paratechs Cryodropper-E 進行小鼠胚胎玻璃化冷凍和使用說明書


Cryodropper for Mouse Embryos 80010 (10 per pouch)

Cryodropper for Mouse Embryos 80010 (10 per pouch)

80010



使用 Cryodropper-E 80010 快速輕松地玻璃化小鼠胚胎


  • 小鼠胚胎的冷凍保存

  • 冷凍保存的小鼠胚胎的儲存

  • 沒有痛苦 - 沒有痛苦

  • 消除手術并發癥

  • 無需麻醉或鎮痛

  • 無術后監測

  • 通過消除證明生存手術合理性的需要來減輕監管負擔

  • 快速簡便的小鼠胚胎玻璃化

  • 無菌且隨時可用

  • 3Rs 實施(減少和細化)


Cryodropper-E 80010 小鼠胚胎玻璃化說明

小鼠胚胎玻璃化:

1.胚胎在 M2 中保存在 37°C 直到冷凍保存。

2.制作玻璃化和預玻璃化培養基。

3.設置便攜式 LN? 氣相冷凍機。[我們使用泡沫聚苯乙烯冷卻器并漂浮。]

4.標記每個 Cryodropper-E。[我們只對燈泡部分進行顏色編碼或標記。]

5.在 Cryodropper-E 燈泡中預加載 100µl 0.5M 蔗糖 M2。將 100µl 滴放在培養皿上,然后移液器放入 Cryodropper-E。握住 Cryodropper-E 的開口端,輕輕將介質輕彈到燈泡部分。輕輕擠壓燈泡以去除胚胎裝載區域中殘留的任何介質,并用 Kimwipe 擦去液體。使用與之前相同的方法或使用凝膠加頂端輕輕定位一滴,將 <5μl 玻璃化介質預加載到吸管區域的中心。在 Eppendorf 架子上開放存儲。

6.在35mm培養皿的蓋子上,裝入一滴M2(每滴20-30μL)、一滴預玻璃化溶液和一滴玻璃化溶液。

7.標記低溫儲存瓶并預冷。[我們使用 4 毫升冷凍管并根據需要貼上標簽。每瓶可裝 4 個 Cryodropper-E。]

8.胚胎首先被轉移到 35mm 培養皿中的 M2 滴。

9.用少量預玻璃化溶液預填充胚胎移液管。在解剖顯微鏡下,將胚胎從 M2 滴轉移到預玻璃化溶液滴。

10.孵育30 秒。

11.用少量玻璃化溶液預填充胚胎移液管。將胚胎從玻璃化冷凍溶液滴轉移到玻璃化冷凍溶液滴。

12.孵育30 秒。

13.收集胚胎并將它們裝入預裝在 Cryodropper-E 中的玻璃化溶液中。[它有助于將顯微鏡聚焦在移液管中的胚胎上。]

14.用熱封機在末端密封 Cryodropper-E。[輕輕測試以確保設備已密封,如果沒有,請再次密封。]

15. 將Cryodropper-E 放入 LN? 中,直到燈泡中的培養基凍結(@10 秒)。儲存在 LN? 蒸氣中的筏子上,直到處理完所有樣品。轉移到小瓶中。

16.然后將小瓶轉移到 LN 2 杜瓦瓶中并儲存在氣相中。

玻璃化小鼠胚胎的解凍:

1.為每個 Cryodropper-E 準備解凍盤,如下所示:一個 60mm 的蓋子,頂部有空間(M2 中 0.1 mL 的 0.5 M 蔗糖),然后每個順時針滴 20-30μl:M2 中的 0.5M 蔗糖,0.25 M2 中的 M 蔗糖和 M2(2 滴)。準備孵化盤如下:60 毫米盤與 100μl KSOM 拉長滴通過中心,30μl KSOM 滴在培養前洗滌胚胎的任一側。用石蠟覆蓋并在 37°C 下用 5% CO? 平衡至少 30 分鐘。

2.將裝有 Cryodropper-E 的小瓶從儲存容器中取出并保存在 LN 2 蒸氣中直至準備解凍。

3.將 Cryodropper-E 浸入 37?C 的水浴中,直到滴管中的培養基解凍(@10 秒)。

4.切下 Cryodropper-E 的頂端,將胚胎放置在培養皿上。將 Cryodropper-E 球莖中的 0.5M 蔗糖 M2 輕輕向下彈到吸管上,然后從 Cryodropper-E 排出到胚胎液滴中,從而最大限度地減少氣泡。使用預裝在 M2 中的 0.5M 蔗糖的胚胎移液管立即從液滴中收集胚胎。

5.胚胎被轉移到一滴新的 0.5M 蔗糖的 M2 溶液中,然后孵育 2 分鐘。

6.使用預裝有 0.25M 蔗糖 M2 的胚胎移液管,將胚胎快速轉移到 M2 中的 0.25M 蔗糖滴中,再孵育 2 分鐘。

7.使用預裝有 M2 的胚胎移液器,將胚胎快速轉移到第一滴 M2 中并孵育 1 分鐘。

8.然后將胚胎通過最后一滴 M2,通過 2 滴 KSOM,然后轉移到油下的長滴 KSOM。

9.胚胎在 37°C 和 5% CO? 條件下培養(桑椹胚晚期或囊胚階段培養 2 天)。

參考文獻:改編自 Wai Hung Tsang 和 King L. Chow 的 B. Stone,BioTechniques Protocol Guide 2010(第 55 頁)doi10.2144/000113258。

 

Cryodropper-E 80010 和 Cryodropper-S 80020 

 

設備:

• 用于胚胎玻璃化的 Cryodropper-E(黑線:ParaTechs 80010)
• Cryovial (4 ml)或其他合適的 LN? 儲存選項(USA Scientific 1440-9100)
• 37?C 的CO? 培養箱
• 玻片加熱器或 37?C 培養箱
• 水浴@ 37°C(500 毫升燒杯水在 37°C 培養箱中效果很好)
• 移液器和吸頭;例如:1ml、200ul、20ul、2ul 
• Eppendorf 管、架
• 帶泡沫聚苯乙烯筏的便攜式 LN? 氣相冷凍機(見下圖)

• 用于標記的細尖Sharpie 
• Kimwipes 
• 組織培養皿;35 毫米、60 毫米
• 胚胎處理移液器和口移液器
• 帶可調光源的立體顯微鏡
• 計時器
• 脈沖熱封機(美國國際電氣 AIE-105T)
• 鑷子
• 剪刀
• LN? 氣相儲存杜瓦瓶
• 用于滅菌的0.22 微米過濾裝置(例如: Millipore SCGVUORE 和 SLGP033RS) 
• 用于介質存儲的冰箱/冰柜

 

所需培養基和試劑:

• M2培養基(Millipore MR-015-D)
• Ficol PM70(Sigma-Aldrich F2878)
•蔗糖(Sigma-Aldrich S1888)
•乙二醇(Sigma-Aldrich 102466)
•二甲基亞砜(DMSO)(Sigma-Aldrich D2650)
• 0.5 M 蔗糖
• FS 
• Pre-VS 
• VS 
• 0.25M 蔗糖
•石蠟油(Sigma-Aldrich 18512) 
• KSOM??培養基 (Millipore MR-121-D)

 

Cryodropper-E 80010 配方: 




PARATECHS 公司有限保修

ParaTechs 保證,在發貨時,產品將符合產品隨附的規格。本保證限制了 ParaTechs 更換產品的責任。  PARATECHS 對產品不作任何其他明示或暗示的保證;包括對任何特定用途的適銷性或適用性的任何保證,或者產品不會侵犯任何第三方的任何專有權利。

 


Cryodropper-S 80020 小鼠精z冷凍保存說明


精z冷凍:


1.在精z冷凍保存前 4-7 天,通過交配(插頭陽性)準備 2 只雄性小鼠(>8 周齡,已證明具有生育能力)。


2.將 60μl CARD CPA 滴在 35mm 培養皿上,為每只小鼠準備 1 個精z培養皿。用石蠟油覆蓋液滴。將第二個 60μl 等分的 CPA 添加到第一滴中,制成高大的半球形 CPA 滴。在 37 ?C 下平衡(不在 CO? 中)。


3.標記每個冷凍滴管。[我們只對燈泡部分進行顏色編碼或標記。]


4.準備 Cryodropper:在培養皿中制備 90μl CARD PM 培養基,每個 Cryodropper 1 滴。在 37°C 和 5% CO? 下平衡 10 分鐘。通過移液將液滴加載到滴管中,然后輕輕地將介質輕彈到燈泡部分。輕輕擠壓燈泡以去除精z裝載區域中殘留的任何介質,并用 Kimwipe 擦去液體。在 37 oC 和 5% CO? 的條件下,將開口存放在 Eppendorf 架子中,直到上樣。


5.用 LN? 設置冷凍箱并使其冷卻。


6.標記低溫儲存瓶并預冷。[我們使用 4 毫升冷凍管并根據需要貼上標簽。每個小瓶可裝 4 個冷凍滴管。]


7.對小鼠實施安樂s。


8.去除附睪尾。將它們放在 Kimwipe 上,并在顯微鏡下*去除所有脂肪和血液。


9.將每個男性的一根附睪轉移到每個精z培養皿中。這使來自兩個男性的精z混合在精z盤中。注意:以下步驟必須快速執行;從精z釋放到冷凍總共不到 30 分鐘。


10.使用制表鉗和小角度剪刀,在每個附睪至少做 6 個切口。


11.將培養皿放在載玻片加熱器上,以 37 oC 加熱 3 分鐘。每分鐘旋轉盤子以從組織中分散精z。當組織從培養基中取出時,輕輕地從組織中擠壓剩余的精z。


12.裝載冷凍滴管:使用凝膠裝載移液器,小心地將 10μl 精z懸浮液的吸管部分裝載在中心。用熱封機密封。將加載的原型直接放在 LN2 蒸氣中的浮子上 10 分鐘。


13.將冷凍滴管轉移到小瓶中。然后將小瓶轉移到 LN 2 杜瓦瓶中并儲存在氣相中。

 

精z解凍:


1.從 LN? 存儲中取出 Cryodropper。


2.浸入 37°C 水浴直至解凍并孵育 10 分鐘。


3.從水浴中取出設備并用 Kimwipe 輕輕擦干。


4.用剪刀剪掉冷凍滴管的頂端,將精z滴轉移到新鮮的試管嬰兒培養皿中。


5.輕輕晃動手腕,輕輕搖動 CARD PM 介質至設備末端。[用力過猛,介質會丟失。]


6.在精z滴上涂抹培養基。[注意:如果使用試管嬰兒培養皿,則應通過外腔中的水保持濕度。如果使用普通的培養皿,精z滴應該在精z解凍前用在 CO? 培養箱中平衡的石蠟覆蓋至少 30 分鐘。]


7.在 CO? 培養箱中在 37 oC 下培養以使其容量化。[我們通常需要大約 45 分鐘。]

 

參考資料:

改編自 Behringer R、Gertsenstein M、Vintersten K、Nagy A. 的 B. Stone,2014 年。操縱小鼠胚胎:實驗室手冊,第 4 版。冷泉港(紐約):冷泉港實驗室出版社。

 

Cryodropper-E 80010 和 Cryodropper-S 80020 

 

所需媒體:


• 石蠟油,(Sigma-Aldrich 18512) 
• FERTIUP 冷凍保護劑 (CPA) (Cosmobio KYD-001)(也可以內部制造,Behringer 等人,第 674-675 頁)
• FERTIUP 預培養培養基 (PM)(Cosmobio KYD-002)(也可以在內部制造,Behringer 等人,第 614 頁)

 

設備:


• 用于精z玻璃化的
冷凍滴管(紅線:ParaTechs 80020)• 冷凍管(4 ml)或其他合適的 LN2 儲存選項(USA Scientific 1440-9100)
• 37 ?C 的 CO? 培養箱 • 玻片
加熱器或 37 ?C 培養箱
• 水浴 @ 37 ? C (在 37°C 培養箱中加入 500 毫升燒杯水效果很好)
• 凝膠加載
吸頭(例如:USA Scientific 1022-0600)• 移液器和吸頭;例如:1ml、200ul、20ul、2ul 
• Eppendorf 架
• 帶泡沫聚苯乙烯筏的便攜式 LN? 氣相冷凍機(見下圖)



• 用于標記的Sharpie 
• Kimwipes 
• 組織培養皿;35 毫米,IVF 培養皿(可選)
• 立體顯微鏡
• 計時器
• 脈沖熱封機(美國國際電氣 AIE-105T)
• 鑷子(制表師 #5)
• 剪刀,解剖和小角度
• LN2 氣相儲存杜瓦瓶

 

動物:


• 用于精z采集的雄性小鼠(證明生育能力,采集前 4-7 天交配)


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